Padronização da técnica MIRU-VNTR para caracterização genotípica da cepa padrão de mycobacterium tuberculosis

Abstract

A técnica de genotipagem Variable Number of Tandem Repeats of Mycobacterial Intersperced Repetitive Units (MIRU-VNTR) é promissora em estudos de epidemiologia. O objetivo deste trabalho é realizar a padronização da técnica MIRU-VNTR para caracterização genotípica de cepas de M. tuberculosis, para as condições oferecidas no laboratório da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Grande Dourados. O protocolo utilizado como referência foi o descrito por De Beer e Kremer. A cepa utilizada de M. tuberculosis padrão de referência H37Rv, foi cultivada em meio de cultura Ogawa-Kudoh e mantida em Meio de Sauton com glicerol 10%, armazenada em criotubos a -70ºC. A extração de DNA genômico de M. tuberculosis foi realizada com o Kit comercial QIAamp. O DNA genômico extraído foi utilizado na amplificação de regiões específicas com auxílio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se 24 pares de primers. As condições de amplificação foram constituídas de uma fase inicial a 95°C por 15 min e 30 ciclos de 95°C por 1 min, 59°C por 1 min e 72°C por 1 min e 30s com extensão final a 72°C por 10 min. Os fragmentos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2,0% corados com Sybr Safe Dna Gel Stain. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram estimados por comparação com marcadores de peso molecular de 50-pb e 100-pb e o número de cópia MIRU por locus foi calculada através do padrão de bandas das imagens geradas por eletroforese. Os resultados obtidos demonstraram que objetivo do trabalho foi alcançado, pois cada loci da cepa H37Rv apresentou o tamanho e número de pares de base correspondentes aos descritos na literatura, mostrando que esta técnica reprodutível foi padronizada para as condições encontradas neste laboratório, sem maiores dificuldades.